miRNA靶点鉴定
分类: miRNA靶点鉴定
发布时间: 2015-04-26 23:21
通过luciferase双萤光报告基因实验等方法来确定miRNA的靶基因。根据主流预测miRNA目标基因软件pictar和targetscan,预测出该miRNA的目标mRNA后,构建luciferase报告基因。
miRNA靶点鉴定主要通过以下几种实验来完成:
一、萤光素酶(Luciferase)双萤光报告基因实验鉴定miRNA靶点
a、实验概述:
构建包含miRNA靶位点的luciferase报告基因,与miRNA mimics共转到细胞当中,通过荧光素酶活性检测,即可分析出miRNA对潜在靶基因的调控作用,可用于miRNA调控潜在靶基因的验证。既可以小规模实验,也可高通量筛选。
原理图
b、实验步骤:
1. 预测miRNA的靶基因及靶位点
协助客户利用Targetscan,Pictar,miRNA.org,RNA22等常用软件预测miRNA的binding位点。
2. miRNA靶点鉴定
1) PCR法或全基因合成获得目的片段;
2) 将目的片段组装到Luciferase报告基因载体;
3) miRNA表达载体构建;
4) Luciferase实验,每个靶点都要做一个对照,每个样品包含内参和三组重复。
二、Luciferase突变实验鉴定miRNA靶点
a、实验概述:
对于前面有效果的miRNA靶基因,将miRNA的binding位点,尤其是seed区突变掉,造成miRNA无法结合,检测luciferase信号是否恢复。原理图:(如图1-1)
b、实验步骤:
1. Luciferase报告基因构建:PCR法,每段突变20个碱基之内,1-2周
2. Luciferase实验:每个样品包含内参和三组重复,根据样品数而定周期。
三、mRNA水平鉴定miRNA靶点
a、实验目的:
由于miRNA作用机制有两个方面,降低mRNA的表达水平和抑制mRNA的翻译水平,所以检测靶点基因的mRNA水平变化将作为一个参考数据,用于分析miRNA作用靶点基因的机制。
b、实验概述:
对于前面有效果的miRNA靶基因,检测mRNA水平是否被miRNA下调。
c、具体内容:
将miRNA mimics和阴性参照转染到细胞中,48-72小时候,提取RNA,荧光定量PCR检测靶点基因的mRNA水平。800/个靶点+800/对照,2个靶点起订。
四、Western Blot实验鉴定miRNA靶点
a、实验目的:
由于miRNA作用机制有两个方面,降低mRNA的表达水平和抑制mRNA的翻译水平,所以检测靶点基因的蛋白水平变化将作为一个参考数据,能全面反映靶点基因的蛋白表达水平的变化,结合mRNA表达水平变化,有助于分析miRNA作用靶点基因的机制。
b、实验概述:
对于前面有效果的miRNA靶基因,检测蛋白水平是否被miRNA下调。
Western Blot实验:每个样品包含内参,客户提供一抗。
c、具体内容:
将miRNA mimics和阴性参照转染到细胞中,48-72小时后,裂解细胞进行Western Blot检测靶点蛋白的水平变化。800/个靶点+800/对照,2个靶点起订。
五、使用靶基因的siRNA验证靶点
实验概述:
miRNA过表达会引起细胞表型的变化,例如迁移、增殖、凋亡,以及靶基因下游基因表达量变化等等。为了证明miRNA是通过负调控靶基因而引起的这些变化,可以使用靶基因的siRNA,检测是否会引起同样的变化。
详见基因沉默服务内容。
六、使用miRNA的抑制剂(Antagomir)验证靶点
a、实验原理:
miRNA antagomir是经过特殊化学修饰的miRNA拮抗剂,通过与体内的成熟miRNA强竞争性结合,阻止miRNA与其靶基因mRNA的互补配对,抑制miRNA发挥作用。
优势:与普通抑制剂相比,miRNA antagomir在动物体内外具有更高的稳定性和抑制效果,且能克服体内细胞膜、组织等障碍富集于靶细胞。(Antagomir的合成:单链的特殊修饰的RNA,2 OD)
b、实验概述:
对于内源有表达的miRNA,可以使用Antagomir,检测靶蛋白表达量是否恢复,检测是否会引起过表达miRNA相反的变化。对于内源没有表达的miRNA,可以先构建miRNA稳定表达细胞系,再进行上述实验。细胞系构建详参慢病毒稳转表达细胞系构建。
七、通过rescue靶蛋白检测功能来验证靶点
实验概述:
对于内源有表达的miRNA,可以构建cDNA表达质粒,过表达靶蛋白,检测是否会有rescue miRNA的抑制效果。对于内源没有表达的miRNA,可以构建miRNA稳定表达细胞系,再进行上述实验。细胞系构建详参慢病毒稳转表达细胞系构建。
八、miRNA靶基因信号通路总结
实验概述:利用prePPI,KEGG等生物信息学软件,总结性分析miRNA调控靶基因及下游信号通路。
一、萤光素酶(Luciferase)双萤光报告基因实验鉴定miRNA靶点
a、实验概述:
构建包含miRNA靶位点的luciferase报告基因,与miRNA mimics共转到细胞当中,通过荧光素酶活性检测,即可分析出miRNA对潜在靶基因的调控作用,可用于miRNA调控潜在靶基因的验证。既可以小规模实验,也可高通量筛选。
原理图
b、实验步骤:
1. 预测miRNA的靶基因及靶位点
协助客户利用Targetscan,Pictar,miRNA.org,RNA22等常用软件预测miRNA的binding位点。
2. miRNA靶点鉴定
1) PCR法或全基因合成获得目的片段;
2) 将目的片段组装到Luciferase报告基因载体;
3) miRNA表达载体构建;
4) Luciferase实验,每个靶点都要做一个对照,每个样品包含内参和三组重复。
二、Luciferase突变实验鉴定miRNA靶点
a、实验概述:
对于前面有效果的miRNA靶基因,将miRNA的binding位点,尤其是seed区突变掉,造成miRNA无法结合,检测luciferase信号是否恢复。原理图:(如图1-1)
b、实验步骤:
1. Luciferase报告基因构建:PCR法,每段突变20个碱基之内,1-2周
2. Luciferase实验:每个样品包含内参和三组重复,根据样品数而定周期。
三、mRNA水平鉴定miRNA靶点
a、实验目的:
由于miRNA作用机制有两个方面,降低mRNA的表达水平和抑制mRNA的翻译水平,所以检测靶点基因的mRNA水平变化将作为一个参考数据,用于分析miRNA作用靶点基因的机制。
b、实验概述:
对于前面有效果的miRNA靶基因,检测mRNA水平是否被miRNA下调。
c、具体内容:
将miRNA mimics和阴性参照转染到细胞中,48-72小时候,提取RNA,荧光定量PCR检测靶点基因的mRNA水平。800/个靶点+800/对照,2个靶点起订。
四、Western Blot实验鉴定miRNA靶点
a、实验目的:
由于miRNA作用机制有两个方面,降低mRNA的表达水平和抑制mRNA的翻译水平,所以检测靶点基因的蛋白水平变化将作为一个参考数据,能全面反映靶点基因的蛋白表达水平的变化,结合mRNA表达水平变化,有助于分析miRNA作用靶点基因的机制。
b、实验概述:
对于前面有效果的miRNA靶基因,检测蛋白水平是否被miRNA下调。
Western Blot实验:每个样品包含内参,客户提供一抗。
c、具体内容:
将miRNA mimics和阴性参照转染到细胞中,48-72小时后,裂解细胞进行Western Blot检测靶点蛋白的水平变化。800/个靶点+800/对照,2个靶点起订。
五、使用靶基因的siRNA验证靶点
实验概述:
miRNA过表达会引起细胞表型的变化,例如迁移、增殖、凋亡,以及靶基因下游基因表达量变化等等。为了证明miRNA是通过负调控靶基因而引起的这些变化,可以使用靶基因的siRNA,检测是否会引起同样的变化。
详见基因沉默服务内容。
六、使用miRNA的抑制剂(Antagomir)验证靶点
a、实验原理:
miRNA antagomir是经过特殊化学修饰的miRNA拮抗剂,通过与体内的成熟miRNA强竞争性结合,阻止miRNA与其靶基因mRNA的互补配对,抑制miRNA发挥作用。
优势:与普通抑制剂相比,miRNA antagomir在动物体内外具有更高的稳定性和抑制效果,且能克服体内细胞膜、组织等障碍富集于靶细胞。(Antagomir的合成:单链的特殊修饰的RNA,2 OD)
b、实验概述:
对于内源有表达的miRNA,可以使用Antagomir,检测靶蛋白表达量是否恢复,检测是否会引起过表达miRNA相反的变化。对于内源没有表达的miRNA,可以先构建miRNA稳定表达细胞系,再进行上述实验。细胞系构建详参慢病毒稳转表达细胞系构建。
七、通过rescue靶蛋白检测功能来验证靶点
实验概述:
对于内源有表达的miRNA,可以构建cDNA表达质粒,过表达靶蛋白,检测是否会有rescue miRNA的抑制效果。对于内源没有表达的miRNA,可以构建miRNA稳定表达细胞系,再进行上述实验。细胞系构建详参慢病毒稳转表达细胞系构建。
八、miRNA靶基因信号通路总结
实验概述:利用prePPI,KEGG等生物信息学软件,总结性分析miRNA调控靶基因及下游信号通路。