内容编辑慢病毒稳转沉默细胞系构建
分类: 慢病毒稳转细胞株
发布时间: 2015-04-26 22:34
构建基于慢病毒表达系统的稳转沉默细胞系（Knock down）。慢病毒系统可非常高效地把基因转染到活体模式生物和几乎所有的哺乳动物细胞中，包括不分化的细胞，不分化细胞处于不活跃或者停止生长的状态，非常难转染，例如神经元细胞、原代细胞、干细胞。将包含shRNA的病毒颗粒被导入靶细胞，可以发挥长期阻断基因表达的作用，建立稳定沉默细胞系。
服务内容
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步骤 |
说明 |
时间 |
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shRNA合成 |
shRNA全长小于100 bp，构建、大提 shRNA全长大于100bp，全基因合成：2.2/bp |
2-3周 |
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沉默效率验证（可选） |
针对上面4个shRNA分别转染目的细胞，qPCR验证基因沉默效率。 |
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慢病毒表达载体构建 |
可供选择的载体： 1）5’LTR—RRE—U6—shRNA—CMV—EGFP—3’LTR 2）5’LTR—RRE—U6—shRNA—3’LTR3）5’LTR—RRE—U6—shRNA—PGK—EGFP—3’LTR 4）5’LTR—RRE—U6—shRNA—PGK—RFPpuro—3’LTR |
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慢病毒包装 |
1x108TU/ml |
200ul |
3-4周 |
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1x108TU/ml |
1ml |
3-4周 |
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1x109TU/ml |
200ul |
4-5周 |
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1x109TU/ml |
1ml |
4-5周 |
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混合克隆筛选 |
流式分选（推荐） |
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2-3周 |
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抗生素筛选 |
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3-5周 |
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筛选稳定沉默细胞株 |
通过qPCR检测（推荐） |
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通过荧光信号检测 |
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公司拥有人类全基因组siRNA文库（约21000 genes），每个基因含三对siRNA序列，大部分已验证沉默效率，抑制效率达到60-95%，并可提供化学合成、质粒、病毒等各种形式载体。参考这些 序列设计shRNA可以大大提高命中比率和抑制效率。您只要提供RefSeq Accession Number，即可查询相关序列。