服务内容
步骤 |
技术方案 |
配套产品 |
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选择技术 |
ES细胞囊胚注射法 |
gRNA-Cas9直接注射受精卵法 |
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明确物种 |
小鼠、大鼠 |
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质粒构建 |
gRNA-Cas9质粒构建及活性验证;donor质粒构建 |
Cas9/gRNA靶点效率检测试剂盒;Cas9/gRNA载体构建试剂盒 |
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得到Founder |
转染mES细胞,筛选抗性克隆,鉴定mES克隆 |
CAS9/gRNA体外转录成mRNA和donor质粒共同显微注射受精卵,移植代孕,构建嵌合体鼠,基因型鉴定 |
核酸免提试剂盒 T7E1酶 |
囊胚注射ES细胞,移植代孕,构建嵌合体鼠,基因型鉴定 |
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得到F1代 |
嵌合体小鼠与野生型小鼠交配,获得稳定称传的loxp鼠F1代杂合子鼠 |
核酸免提试剂盒 T7E1酶 |
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条件性敲除鼠获得 |
Cre工具鼠与F1交配 |
核酸免提试剂盒 T7E1酶 |
相关知识
Cre/loxP系统来源于噬菌体,可以介导位点特异的DNA重组。该系统含有两个组成成分:一个是一段长34bp的DNA序列(LoxP序列), 含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。 LoxP的方向由中间这8个碱基决定。这段LoxP序列是Cre重组酶识别的位点。 令一个组成部分是Cre重组酶。它是由噬菌体编码的一种由343个氨基酸组成的蛋白。Cre可以介导两个LoxP位点的重组,从而引起两个LoxP之间 DNA序列的缺失。如果将Cre重组酶cDNA通过基因工程的手段置于组织或细胞特异性启动子之下,可以得到Cre组织/细胞特异性表达的Cre小鼠,也叫Cre工具小鼠。 跟Flox小鼠交配之后,可以得到条件性基因敲除小鼠。
所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个 LoxP序列。这段序列就是Flanked by LoxP,也就叫做Flox小鼠。这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得。这种小鼠跟 Cre工具小鼠交配,由于Cre的表达,介导两个LoxP位点序列的重组,从而敲除两个LoxP之间的序列。由于不同Cre工具小鼠的Cre表达有组织/ 细胞特异性,就可以达到在不同组织、细胞里特异性敲除目的基因的目标。比如上皮细胞、胸腺细胞、T细胞、B细胞、心肌细胞、肠道、肺脏等。
Cre-LoxP系统已经用了将近20年了,科学家研发了很多的Cre工具鼠。因此,对鼠而且言,条件性敲除最主要的工作是构建一个loxP的转基因鼠。