内容编辑TALE质粒组装及活性验证
分类: TALEN
发布时间: 2015-04-25 16:19
_lit.png)
组装TALEN打靶质粒及切割活性验证。TALEN（transcription activator-like (TAL) effector nucleases）是一种人工改造的限制性内切酶，将识别特异DNA序列的TALE与内切核酸酶FokI偶联，可构建成剪切特异DNA序列的内切酶TALEN。而且FokI需形成二聚体方能发挥活性，大大减少了随意剪切的几率。在实际操作中，需在目标基因的编码区或外显子和内显子的交界处选择两处相邻（间隔13-22碱基）的靶序列（一般16-20个碱基）分别进行TALE识别模块构建。将这两个相邻靶点识别模块（分别）融合克隆到FokI的N-末端，形成真核表达载体，得到TALEN质粒对。
服务内容
| 项目 | 说明 | 周期 | 配套产品 |
| 靶点设计 | 免费设计靶点或者客户提供靶点信息 | ||
| TALEN质粒组装 | 使用E-TALEN和纳米自组装技术（PCT专利）组装左臂和右臂，多种不同动物载体可供选择（附后）。 | 1周 | E-TALEN（增强型）载体构建试剂盒 |
| 植物双元载体连接 | 将TALEN质粒的ORF亚克隆到植物双元载体pCAMBIA-1301骨架，多种载体可供选择（附后）。 | 1周 | 植物TALEN载体构建试剂盒 |
| SSA靶点活性检测 | 将靶序列构建到SSA活性报道质粒，同TALEN质粒对共转染到人类293T细胞，检测luciferase活性。可提供SSA活性大于3的TALEN质粒（可选）。 | 1周 | SSA活性报道质粒构建试剂盒 |
| 细胞内源活性验证 | 将TALEN质粒转入目标细胞（植物为原生质体），扩增靶序列，T7E1酶切检测率。可提供内源活性大于5的靶点TALEN质粒（可选） | 1周 | 核酸免提试剂盒T7E1（检测突变） |
TALEN载体
|
编号 |
描述 |
骨架 |
|
| VK006-01 | 哺乳动物基因组DNA剪切(CAG- Sp6) | E-TALEN |
|
| VK006-02 | 哺乳动物基因组DNA剪切(CMV- Sp6) |
E-TALEN |
|
| VK006-03 | 哺乳动物基因组DNA剪切(CMV- Sp6)；GFP/mCherry标签 |
E-TALEN |
|
| VK006-04 | 哺乳动物基因组DNA剪切(CMV- T7)；GFP/mCherry标签 |
E-TALEN |
|
| VK006-05 | 动物基因敲除(CMV- T7)；哺乳动物kozaK列，体外转录mRNA |
E-TALEN |
|
| VK006-06 | 家蚕基因敲除(CMV- T7)；家蚕kozaK序列，体外转录mRNA |
E-TALEN |
|
| VK006-07 | 果蝇基因敲除(CMV- T7)；果蝇kozaK序列，体外转录mRNA |
E-TALEN |
|
| VK006-08 | 激活內源基因的转录(CAG- Sp6)；TALEA or TALE-TF |
TALEA |
|
| VK006-09 |
激活內源基因的转录(CMV-
Sp6)；TALEA or TALE-TF |
TALEA |
|
| VK006-10 | 哺乳动物基因组DNA剪切(CMV- Sp6)；puro-GFP标签 |
E-TALEN |
|
| VK006-11 | 哺乳动物基因组DNA剪切(CAG- Sp6)；puro-GFP标签 |
E-TALEN |
|
| VK006-12 | 哺乳动物基因组DNA剪切(CAG- Sp6)；GFP/mCherry标签 |
E-TALEN |
|
| VK006-13 | 哺乳动物基因组DNA剪切(CAG- T7)；GFP/mCherry标签 |
E-TALEN |
|
TALEN植物双元载体
□35s-talen，Nos- Hyg
□35s-talen，35s- Hyg
□super-talen，35s-tfdA (棉花用双元载体)
□35s-talen，35s- bar
□Ubi-talen，35s- bar
这些双元载体以pCAMBIA-1301为骨架改造而成，其有效性已经过验证。pTALED-L 与 pTALED-R 用于转化双子叶植物 (例如拟南芥、西红柿、烟草) 靶向基因操作；pTALEM-L与pTALEM-R用于转化单子叶植物(例如水稻等) 靶向基因操作。
实验数据
新一代增强型E-TALEN（Enhanced TALEN)是对TALEN结构进行持续优化改造而来。实验表明E-TALEN比TALEN活性更好，剪切效率更高。
图2. 分别转染TALEN、E-TALEN后，细胞基因组PCR产物T7E1酶切结果对比