TALE是由12个或以上特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，第12和13位残 基是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的双连氨基酸残基 (RVDs)位点，每个RVD仅能识别一个碱基。12、13位点双连氨基酸残基与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NG识别T，HD识别C，NI识别 A，NN识别G。只须按照DNA序列将相应TALE单元串联克隆即可获得识别某一特定核酸序列的TALE。对于哺乳类动物包括人类，一般选取 16-20bp的DNA序列作为识别靶点。组成的TALE识别模块与核酸酶或转录激活因子相连，导入细胞即可实现基因敲除或激活。

TALE技术应用

（1）TALEN（transcription activator-like (TAL) effector nucleases）

TALEN可用于基因敲除（Knock-out）和基因敲入（Knock-in）。TALEN由识别特异DNA序列的TALE与一个 核酸酶内切酶的切割域（FokI）构成。TALEN通过DNA识别域结合到靶位点上，FokI的切割域形成二聚体，可以特异性的切断目标基因，损伤后的 DNA在非同源末端连接修复过程中，会由于碱基的随机增减造成目标基因功能缺失。而且FokI需形成2聚体方能发挥活性，大大减少了随意剪切的几率。它克 服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的活性，使基因操作变得更加简单、方 便。在实际操作中，需在目标基因的编码区或外显子和内显子的交界处选择两处相邻（间隔13-22碱基）的靶序列（一般16-20个碱基）分别进行TAL识 别模块构建。将这两个相邻靶点识别模块分别融合克隆到FokI的N-末端，形成真核表达载体，得到TALEN质粒对。将TALEN质粒对共转入细胞后，表 达的融合蛋白，分别与靶位点特异结合，由于两个TALEN融合蛋白中的 FokI临近，形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA，形成DSB（Double-Strand Breaks）,诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过NHEJ（Non-homologous End Joining）修复DNA，在此修过程中或多或少地删除或插入了一定数目的碱基，造成移码，形成目标基因敲除突变体。 

当通过TALEN产生DSB后，若能提供同源修复模板，细胞可通过同源重组方式修复DNA，因此可以对内源DNA做更精细的操作，如基因敲入、点突变、加标记（GFP、HA、Flag…）。

（2）TALEA（transcription activator-like (TAL) effector activator）

TALEA可用于基因转录激活/过表达。将识别特异DNA序列的TALE与转录因子激活区域VP64(VP64 Activation Domain)融合，可构建成识别启动子上特异DNA序列的转录激活因子TALEA。在实际操作中，需在目标基因的启动子上游选取靶序列（一般提高特异内 源基因的表达水平，12-18 个碱基），构建TAL识别模块。将识别模块TALE融合克隆到VP64的N-末端，形成真核表达质粒TALEA。将TALEA质粒转入细胞中，表达的融合 蛋白结合启动子附近的特异DNA序列，并通过VP64激活区域与PolII结合，从而激活基因的转录，提高了内源目标基因的表达。

TALE技术特点

1. 无基因序列、细胞、物种限制，已成功应用于多种动物和植物；

2. 设计简单，打靶准确，TALE的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系，；

3. 成功率几乎100%；

4. 特异性高，脱靶效应很少见，可靠性强。

增强型TALEN（E-TALEN）

增强型TALEN（Enhanced TALEN)对TALEN结构进行优化。实验表明，E-TALEN相对于TALEN的剪切效率更高，使用E-TALEN将会大大提高实验者后续实验操作的效率。

图1 TALEN、E-TALEN SSA检测信号活性对比

图2 分别转染TALEN、E-TALEN后，细胞基因组PCR产物T7E1酶切结果对

我们的优势

1. 特有纳米打印自组装TALEN技术（已申报PCT专利）使得我们构建TALEN(A)时间大大缩短，成本极大降低。我们的方法比市场现有方法快一倍，而且成本降低一倍。

2. 业内顶尖的技术支持团队。我们专业人员具备深厚细胞分子生物学技术、多年的模式生物重组经验，加上一流的服务理念，能百分之百满足客户的需求。除付费服务 外，对于意义重大的项目，可以采取各种合作方式，尽快先开展客户的课题，以充分保证客户项目的进展。我们的团队既有留学美国顶级学校的的高级科学家，他们 曾就职美国多家著名医药公司的首席科学家职位,也有毕业于国内顶级院校的的研究人员。因此，我们能随时与客户进行深入沟通，帮助客户分析研究难题，并提供 最优解决方案，从而满足各种实验研究需求。

3. 灵活的合作（运营）模式。可以通过合作共享成果的模式，尽快开展客户的课题。

部分案例

本公司自提供TALEN技术服务以来，已累计成功构建了4000多对已验证活性的TALEN质粒，累计为北京大学、清华大学等数10家国内重点院校、科研机构、医院提供了上百例基因敲除的小鼠和大鼠。得到了客户的广泛认可，其中比较有代表性案例有：

1、中科院动物所客户在成纤维细胞中，分别成功构建三个基因敲除的细胞系，效率在10-20%（其中一个基因的双链敲除效率达到20%）。

2、北京大学客户从服务开始的两个月时间内，拿到6个Knock-in细胞系。

3、西南家蚕实验室从本公司提供服务开始，不到3个月时间拿到基因敲除的家蚕突变体。

4、台湾中原大学使用本公司提供的质粒陆续成功构建了5种基因敲除